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本发明提供一种目标基因片段缺失突变体细胞的制备方法，所述方法至少包括以下步骤：(1)将sgRNAs组转染到同一宿主细胞中，所述sgRNAs组中，包含2个sgRNA，且2个sgRNA靶向同一目的基因的不同靶点；所述sgRNAs组的数量为一个或多个；当所述sgRNAs组的数量为多个时，不同sgRNAs组靶向不同目的基因；(2)富集表达2个或多个所述sgRNAs的宿主细胞；(3)培养步骤(2)获得的宿主细胞，获得表达目标基因片段缺失的突变体细胞。本发明采用共转染结合短时间药物筛选，能够在培养细胞中富集同时包含表达2个或多个sgRNA的细胞，从而在小鼠胚胎干细胞高效获得发生基因片段缺失突变体细胞。