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限制性内切酶在分子生物学研究中是一类重要的工具酶，目前主要由异源生物合成的方式进行表达与生产，由于它们对特定的DNA序列(即酶切位点)具有切割活性，在异源表达时会对宿主产生较高的细胞毒性。而无细胞生物合成体系具有操作快捷、灵活高效、无细胞毒性等优势，因此，本研究利用无细胞蛋白合成(cellfree protein synthesis, CFPS)技术进行限制性内切酶的表达制备。本课题组选择3种限制性内切酶Eco RⅠ、BamHⅠ和BsaⅠ作为研究对象，构建线性DNA为表达模板，无需甲基化酶对宿主的保护，在6 h内即可完成蛋白表达。经亲和色谱与凝胶色谱两步纯化，得到了纯度高(95%左右)、酶活相当(EcoRⅠ3.7×105～3.7×106 U/mg,BamHⅠ8.3×102～4.1×103 U/mg,BsaⅠ4.4×105～4.4×106 U/mg)的目标蛋白。同时，建立了限制性内切酶的实时酶活检测方法，将有助于限制性内切酶的催化和快速筛选研究。本研究所开发的限制性内切酶无细胞表达制备体系，从基因模板构建到纯化蛋白所需时间短(1～2 d)、蛋白产量高(32.5～130 mg/L无细胞反应)、制备效率高(1.3×105～5.7×108 U/L无细胞反应)，具有较好的普适性，为限制性内切酶的研发与制备生产提供了新的思路。